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WB常見問題原因分析

問題

可能原因

驗證或解決辦法

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

無信號

一抗和二抗不匹配

二抗需和一抗宿主的物種相同(如一抗來自兔,二抗為抗兔抗體)。

沒有足夠的一抗或二抗結合目標蛋白

使用高濃度抗體,延長4℃孵育時間(如過夜)。

封閉劑與一抗或二抗有交叉反應

使用溫和的去污劑如吐溫-20,或更換封閉劑(常用的脫脂奶粉、BSA、血清或明膠)。

一抗不識別檢測物種的蛋白

參照說明書,比對免疫原序列和蛋白序列以確保抗體和目的蛋白會發生反應,設置陽性對照。

抗原量不足

每泳道蛋白上樣量不低于20-30μg,使用蛋白酶抑制劑并設置陽性對照。

組織中目的蛋白含量低

濃縮使信號最大化(例如檢測核蛋白要用核裂解物)。

轉膜不充分

使用可逆染色劑例如麗春紅S檢測轉膜效果,檢查轉膜操作是否正確。PVDF膜需預先浸在甲醇中,然后浸到轉移緩沖液中。

洗膜過度

勿過度洗膜。

過度封閉使目標蛋白不能顯色

代替5%脫脂奶粉,使用含0.5%脫脂奶粉或無脫脂奶粉的抗體稀釋液,或更換封閉劑,減少封閉時間。

一抗失效

使用新鮮一抗,重復使用有效濃度會降低。

二抗受疊氮鈉抑制

避免疊氮鈉和HRP標記抗體一起使用。

檢測試劑盒過期和底物失活

使用新鮮的底物。

 

 

 

 

 

 

背景高

未進行非特異性封閉或封閉不充分

延長封閉時間,考慮更換合適的封閉劑。推薦使用5%脫脂奶粉、3%BSA或血清封閉30分鐘。這些可以包含在抗體緩沖液中。

一抗濃度過高

稀釋抗體至合適濃度,以更高稀釋度抗體孵育更長時間。

抗體孵育溫度過高

4℃孵育。

二抗與封閉劑非特異性結合或反應

設置二抗對照(不加一抗)。

一抗或二抗與封閉劑有交叉反應

在孵育和洗滌液中加入溫和去污劑如吐溫-20。脫脂奶粉含有酪蛋白,該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白,會結合磷酸化特異性抗體而易產生高背景。使用BSA代替奶粉作為封閉劑。

未結合蛋白質洗滌不充分

增加洗滌次數。

膜的選擇導致的高背景

NC膜比PVDF膜背景低。

膜干燥

在孵育過程中防止膜變干,在任何步驟都保證膜有充分的反應液,放入攪拌子不斷攪動或輕輕震蕩使膜浸在溶液中。

 

 

 

 

 

 

 

 

多帶現象

細胞傳代次數過多,使其蛋白表達不同

使用原始未傳代的細胞株,和現在的細胞株一起做平行對照實驗。

體內表達的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等

查閱文獻,使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯后的修飾。

蛋白樣本降解(蛋白質分子量降低)

在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。

檢測到未經報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結構不同的蛋白

查閱其他文獻報道,或BLAST搜尋,使用說明書推薦的細胞株或組織。

一抗濃度過高,高濃度時常出現多條蛋白帶

降低抗體濃度和/或孵育時間。

二抗濃度過高,高濃度產生非特異性結合

降低抗體濃度,增加二抗對照(不加一抗)。

抗體未經純化

使用親和純化的抗體,減少非特異性條帶。

條帶為非特異性條帶

應用封閉多肽來區分特異性和非特異性條帶,只有特異性條帶能被封閉從而消失

靶蛋白形成多聚體

SDS-PAGE電泳上樣前,煮沸10分鐘而不是5分鐘,使蛋白解聚

背景有不均勻的白色斑點

轉膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均

轉膜過程中盡量去除氣泡,抗體孵育時保持搖動。

背景有黑色斑點

抗體結合了封閉劑

過濾封閉劑。

深背景出現白色條帶(非預期背景)

一抗或二抗加入過多

稀釋抗體的濃度。

分子量蛋白標準條帶呈黑色

抗體和分子量蛋白標準發生了反應

在分子量蛋白標準和第一個樣品之間增加一個空白條帶。

目的條帶染色過低/過高

分離不徹底

改變凝膠比例:分子量大的蛋白用低濃度膠,分子量小的蛋白用高濃度膠。

“微笑”條帶

遷移過快;電泳溫度過高(改變了PH值和遷移速度)

降低遷移速度或低溫電泳(冰庫或冰上)。

相同的蛋白雜交出現大小不均勻條帶

制備凝膠時凝膠凝固太快,致使泳道中丙烯酰胺的比例不均勻

參照凝膠的配方,在凝膠中加入適量TEMED,放置時在凝膠頂部加入適量0.1%SDS(水稀釋)以防凝膠變干。

凝膠染色不均勻

細菌污染;抗體量不足

4℃保存抗體并使用新鮮的緩沖液浸泡凝膠;確保在振蕩孵育時抗體充分浸沒膜。

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