Flow Cytometry

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流式分析樣品的準備

流式一、

樣品的準備

試驗一:組織培養細胞的細胞準備

材料   

AccutaseTM Enzyme Cell 完全培養基(eBioscience Cat.No. 00-4555)  流式細胞儀染色液(eBioscience Cat.No. 00-4222)  15或50ml尖底離心管

實驗過程

1. 對于懸浮培養的細胞,把細胞分裝到一個尖底離心管中,對細胞進行計數和活性分析,然后進入步驟3;

2. 對于貼壁培養的細胞,建議用AccutaseTM Enzyme Cell 完全培養基從培養皿上吹起并吹散細胞凝聚物,然后把細胞分裝到一個尖底離心管中,對細胞進行計數和活性分析,進入步驟3;

3. 離心細胞然后用流式細胞儀染色液重懸細胞使其終濃度為2×107個細胞/ml。

試驗二:淋巴組織的細胞準備

材料  

60×15 mm 組織培養皿  

3 ml注射器  

細胞濾網(血液尼龍濾網)  

流式細胞儀染色液(eBioscience Cat.No. 00-4222)  

15或50ml尖底離心管

實驗過程

1. 采集組織(采集組織(脾,淋巴結,胸腺)放進一個細胞培養皿中,用3 ml注射器的活塞擠壓以制成單細胞懸液,此過程用10ml的染色緩沖液;

2. 加入10ml染色液收集細胞,使細胞懸液通過尼龍濾網以除去成團的細胞和細胞碎片,收集細胞懸液于尖底離心管中;

3. 4℃離心細胞懸液4-5分鐘(300-400g),棄掉上清液;

4. 重懸細胞沉淀,細胞計數和活性分析;

5. 按照步驟3離心細胞然后用合適體積的染色液重懸細胞,使細胞終濃度為2×107個細胞/ml。

試驗三:非淋巴組織的細胞制備

材料  

剪刀或者手術刀片  

PBS   

60×15 mm 組織培養皿  

3 ml注射器  

細胞濾網(血液尼龍濾網)  

流式細胞儀染色液(eBioscience Cat.No. 00-4222)  

15或50ml尖底離心管  

實驗過程

1. 采集組織,用剪刀或手術刀切成2-4mm的小塊;

2. 按照酶的使用說明書,加入適量用PBS稀釋的酶,孵育。酶的選擇可以參照以下網站:http://www.tissuedissociation.com;

3. 用移液管輕輕吹散細胞,并用濾網過濾除去成團的細胞和細胞碎片;

4. 4℃離心細胞懸液4-5分鐘(300-400g),棄掉上清液;

5. 用PBS重懸細胞沉淀以移除剩余的酶溶液;

6. 重復步驟4;

7. 重復步驟5和6;

8. 用流式染色液重懸細胞沉淀,細胞計數和活性分析;

9. 按照步驟4離心細胞然后用合適體積的染色液重懸細胞,使細胞終濃度為2×107個細胞/ml。

試驗四:

材料  

PBS   

FicollTM或其它的培養基  

流式細胞儀染色液(eBioscience Cat.No. 00-4222)  

15或50ml尖底離心管實驗過程

1. 在尖底離心管中用PBS按1:1的比例稀釋血樣;

2. 用FicollTM 等倍稀釋樣品;

3. 離心20分鐘;

4. 收集PBS和FicollTM交界處的PBMC;

5. 在試管中加入PBS;

6. 4℃離心細胞懸液4-5分鐘(300-400g),棄掉上清液;

7. 用流式染色液重懸細胞沉淀,細胞計數和活性分析;

8. 按照步驟6離心細胞然后用合適體積的染色液重懸細胞,使細胞終濃度為2×107個細胞/ml。   

用淋巴組織細胞懸液在流式細胞儀上分析以前,最好去掉紅細胞。

試驗一:鼠脾細胞中紅細胞的裂解:

材料  

1×PBS   

eBioscience 紅細胞裂解液(Cat.No.00-4333)   

50ml 尖底管

1. 采集小鼠的脾臟并且制成單細胞懸液;

2. 4℃ 離心沉淀細胞(300-400g),棄掉上清液;

3. 用5ml脾的紅細胞裂解液重懸細胞;

4. 室溫震蕩孵育4-5分鐘(也可在冰上進行);

5. 加入20-30ml PBS 停止反應;

6. 4℃ 離心沉淀細胞(300-400g),然后用合適體積的緩沖液重懸細胞沉淀,繼續下一步試驗;

7. 細胞計數。

試驗二:小鼠血液的紅細胞裂解

材料  

1×PBS   

eBioscience 紅細胞裂解液(Cat.No.00-4333)   

50ml 尖底管

1. 1ml小鼠血液中加入10ml 紅細胞裂解液;

2. 室溫震蕩孵育4-5分鐘(也可在冰上進行);

3. 加入20-30ml PBS 停止反應;

4. 4℃ 離心沉淀細胞(300-400g),然后用合適體積的緩沖液重懸細胞沉淀,繼續下一步試驗;

5. 細胞計數。

試驗三:人外周血中紅細胞的裂解

材料  

1×PBS   

eBioscience 紅細胞裂解液(Cat.No.00-4333)   

50ml 尖底管

1. 1ml人的血液中加入10ml 紅細胞裂解液;

2. 室溫孵育10分鐘(不要超過15分鐘);

3. 加入20-30ml PBS 停止反應;

4. 4℃ 離心沉淀細胞(300-400g),

然后用合適體積的緩沖液重懸細胞沉淀,繼續下一步試驗;

5. 細胞計數。

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