流式胞內蛋白染色，很關鍵的一點是需要知道要染的蛋白在哪個位置，這樣才能選對操作流程和buffer體系。例如，核內蛋白和大部分分泌蛋白要用eBioscience 的Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience Cat. No. 00-5523)，而像細胞因子和趨化因子這類分泌蛋白要用Intracellular Fixation and Permeabilization Buffer Set (eBioscience Cat. No. 88-8824)。對于磷酸化信號通路蛋白，不能用以上兩種buffer體系，而要用Fixation/Methanol Protocol。

 

eBioscience針對流式胞內染色推出了三種解決方案：

方案A：兩步法胞內蛋白染色（細胞質），用于檢測可以通過體內或體外激活的單個細胞的胞漿蛋白、細胞因子或其他的分泌蛋白。

方案B：一步法胞內蛋白染色（細胞核），用于檢測核內蛋白，如轉錄因子。

方案C：兩步法Fixation/Methanol，用于檢測磷酸信號分子，如MAPK和STAT蛋白等。

 

注意：

1、  流式抗體要避光儲存于2-8°C，嚴格避免反復凍融。

2、  使用抗體前，快速旋轉使抗體恢復到最大體積，不建議斡旋混勻抗體。

3、  除操作說明外，所有的染色步驟一律在冰上或4℃避光操作。

4、  緩沖液中加BSA或FBS可以減少固定破膜后的非特異性背景。

5、  固定和透化作用將影響eFluor納米晶體的亮度，建議使用最短的固定和透化作用時間，染色后立即上機檢測分析。

 

方案A: 兩步法胞內蛋白染色（細胞質）

實驗材料：
12×75mm圓底檢測流式管。
[可選]可固定的活度染料eFluor®450,506,660, or 780 (eBioscience Cat. No. 65-

0863,65-0866,65-0864,65-0865)
胞內抗原的直標抗體。
胞內Fixationand Permeabilization Buffer Set(eBioscienceCat. No. 88-8824)，稀釋到1x使用
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)

刺激劑：CellStimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors)(500X)(eBioscience Cat.No. 00-4975) or ProteinTransport Inhibitor Cocktail(500X) (eBioscience Cat. No.00-4980) or Brefeldin ASolution (eBioscience Cat.No. 00-4506) or MonensinSolution (eBioscience Cat. No. 00-4505)

實驗流程： 
1、按照流式樣品要求制備單細胞懸液。

2、按照流式表面染色方法標記細胞表面抗原，緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細胞。

3、加100ul ICFixationbuffer ，斡旋固定細胞，室溫避光孵育20-60min。

4、每管加2ml1×permeabilization buffer，300-400xg室溫離心5min，棄上清。

5、每管加2ml1×permeabilization buffer重懸細胞，300-400xg室溫離心5min，棄上清。

6、每管加100ul1×permeabilization buffer 重懸細胞后，加入檢測胞內抗原的抗體，室溫避光孵育20-60min。
7、每管加2ml1×permeabilizationbuffer洗一次，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
8、每管加2ml FlowCytometry Staining Buffer，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
9、每管適量流式染色液重懸即可上機檢測，同行對照依照上述步驟進行。

 

方案B：一步法胞內蛋白染色（細胞核）

實驗材料：
12×75mm圓底檢測流式管或96孔尖底或圓底微孔板。
[可選]FixableViability Dyes eFluor 450, 506,660 and 780(eBioscience Cat. No. 65-

0863,65-0866,65-0864,65-0865)

胞內抗原的直標抗體。
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience Cat. No. 00-5523) 
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)

實驗流程一（試管）
1、按照流式樣品要求制備單細胞懸液。
2、按照流式表面染色方法標記細胞表面抗原。緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細胞。
3、每管加1mlFoxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品最長可以四度固定18小時）。
4、每管加2ml1×permeabilizationbuffer，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
5、每管加2ml1×permeabilizationbuffer重懸細胞，300-400xg 室溫離心5min,棄上清。
6、每管加100ul1×permeabilizationbuffer重懸細胞。

7、可選：每管加入2ul 2%normal mouse/rat serum 封閉，室溫孵育15分鐘。

8、每管加入熒光標記抗體，室溫避光孵育30min。
9、每管加2ml1×permeabilizationbuffer洗一次，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
10、每管加2ml1×permeabilizationbuffer或FlowCytometry Staining Buffer，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
11、每管加適量FlowCytometry Staining Buffer重懸細胞，即可上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。

實驗流程二（96孔微孔板）

1、按照流式樣品要求制備單細胞懸液。
2、按照流式表面染色方法標記細胞表面抗原。緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細胞。
3、每孔加200 µLFoxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品最長可以四度固定18小時）。300-400xg室溫離心5min，棄上清。，

4、每孔加200 µL1×permeabilizationbuffer，300-400xg 室溫離心5min,棄上清。

5、重復步驟4。
6、每孔加100ul1×permeabilizationbuffer重懸細胞

7、可選：每孔加入2ul 2%normal mouse/rat serum 封閉，室溫孵育15分鐘。

8、每孔加入熒光標記抗體，室溫避光孵育30min。
9、每孔加200 µL1×permeabilizationbuffer洗一次，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
10、每孔加200 µL1×permeabilizationbuffer或FlowCytometry Staining Buffer，300-400xg室溫離心5min，棄上清。
11、每孔加適量Flow CytometryStaining Buffer重懸細胞，即可上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。

 

方案C：兩步法Fixation/Methanol

實驗材料：
12×75mm 圓底檢測流式管或96孔尖底或圓底微孔板。
胞內抗原的直標抗體

eBioscienceFlowCytometry Staining Buffer (Cat. No. 00-4222)

eBioscienceICFixation Buffer (cat. 00-8222)

90-100% 甲醇(HPLC 級)

可選Fc Block：Anti-Mouse CD16/CD32 Purified(eBioscienceCat. No. 14-0161) or Human Fc ReceptorBinding Inhibitor Purified(eBioscienceCat. No. 14-916 ）

實驗流程

1、準備刺激細胞的刺激劑，用刺激劑重懸細胞使細胞濃度達1-5x106cells/mL，37℃培養一段時間（刺激時間依樣品而定）。取未刺激的細胞同樣處理作為陰性對照。

2、固定細胞：ICFixationBuffer按1:1直接加到細胞里，斡旋混勻，室溫，避光孵育10-60min。

3、室溫600xg離心4-5min，棄上清。

4、重懸細胞，加1mL冰冷的90-100%甲醇，渦旋混勻，4℃或冰上孵育至少30min。

注意：細胞加了甲醇，可以在<-20℃條件下保存超過4周。

5、用FlowCytometryStaining Buffer洗滌細胞，室溫600xg離心4-5min，棄上清。

6、用 FlowCytometryStaining Buffer重懸細胞，將細胞濃度調至1x10⁷cells/mL 。

7、取100 μL(1x106cells)細胞到流式管。

8、可選：染色前可以使用MouseCD16/ CD32抗體或人類Fc受體抑制非特異性結合。

9、加熒光標記抗體，室溫避光孵育30-60min。

注意：如果需要，表面染色和胞內磷酸染色可以同時進行，因為不是所有的抗體克隆號都結合到一個固定位點，請查閱固定和甲醇處理后細胞染色的抗體克隆號表。

10、用2mL FlowCytometryStaining Buffer洗滌細胞，室溫600xg離心4-5min，棄上清。重復一次。

11、用適量的FlowCytometryStaining Buffer 重懸細胞后上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。

 

實驗流程（96孔微孔板）

1、準備刺激細胞的刺激劑，用刺激劑重懸細胞使細胞濃度達1-5x106cells/mL，

2、取96孔微孔板，每孔加100μL刺激劑，再加100 μL細胞，37℃培養一段時間（刺激時間依樣品而定）。取未刺激的細胞同樣處理作為陰性對照。

3、固定細胞：ICFixationBuffer按1:1直接加到細胞里，斡旋混勻，室溫，避光孵育10-60min。

4、室溫600xg離心4-5min，棄上清。

5、重懸細胞，加1mL冰冷的90-100%甲醇，渦旋混勻，4℃或冰上孵育至少30min

注意：細胞加了甲醇，可以在<C的條件下保存超過4周。°-20

6、用200 μLFlowCytometry Staining Buffer 洗滌細胞，室溫600xg離心4-5min，棄上清。重復一次。

7、可選：染色前可以使用Mouse 的CD16/CD32純化抗體或人類Fc受體抑制分特異性結合。

8、加熒光標記抗體，室溫避光孵育30-60min。

注意：如果需要，表面染色和胞內磷酸染色可以同時進行，因為不是所有的抗體克隆號都結合到一個固定位點，請查閱固定和甲醇處理后細胞染色的抗體克隆號表。

9、用2mL FlowCytometryStaining Buffer洗滌細胞，室溫600xg離心4-5min，棄上清。重復一次。

10、用適量的FlowCytometryStaining Buffer 重懸細胞后上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。