Flow Cytometry

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流式表面抗原染色方法

方案A:細胞懸液的表面抗原染色。
方案B:一步法胞內蛋白染色(細胞核)。

小貼士:
1、流式抗體要儲存于避光4度,嚴格避免凍融。
2、流式抗體使用前要離心3min,避免貼壁蓋的損失,請勿斡旋混勻。
3、避免細胞成團,以免堵塞流式細胞儀。
4、eFluor納米晶體抗體參照該品說明進行改善。


方案A: 細胞懸液的表面抗原染色

實驗材料:

15×75mm圓底流式管或96孔板
直標一抗或純化抗體
二抗(可選)
抗小鼠CD32/16抗體(eBioscience Cat. No. 14-0161)
人FC?R結合抑制劑(eBioscience Cat. No. 14-9161)
流式染色液(eBioscience Cat. No. 00-4222)可自行配制
eFluor納米晶體抗體染色液(eBioscience Cat. No. 00-3222;可選)
7-AAD活度染色液(eBioscience Cat. No. 00-6993)或PI染色液(eBioscience Cat. No. 00-6990)

實驗流程:
1、按照樣品細胞制備方案制備懸浮細胞,調整濃度為2×107/ml。
2、(可選)封閉FCR介導的非特異性反應:
小鼠:染色之前加0.5ug-1ug/100ul CD16/32抗體,孵育20min。
人類:染色之前加20ul 人FCR結合抑制劑孵育20min。
3、等分細胞懸液,每管50ul,再補加50ul染色液。
4、按照抗體說明書加入適量抗體,輕彈混勻。
5、直標抗體。


方案B:淋巴組織細胞制備

實驗材料:

60×15mm 的組織培養皿
[5ml 注射器
細胞過濾器(尼龍網過濾)
eBioscience® 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)
15ml或50ml的離心管。

注意:
Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀釋為工作液(1:4稀釋)。

實驗方案:
1、按照流式樣品要求制備單細胞懸液。
2、按照流式表面染色方法標記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次,離心完全棄上清。斡旋分散細胞。
3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液,斡旋固定細胞。室溫或四度避光孵育30-60min(小鼠樣品最長可以四度固定18小時)。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室溫離心5min,棄上清。
6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細胞。
7、300g 室溫離心5min,棄上清。
8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細胞后,加入二抗FOXP3 (或其他胞內抗原抗體),室溫避光孵育20min。
9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次,300g 室溫離心5min,棄上清。
10、加2ml 流式染色液,300g 室溫離心5min,棄上清。
11、適量流式染色液重懸,即可上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。軟件分析結果。

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