細胞凋亡

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PI單染檢測細胞周期

原理:
碘化丙啶(Propidium ,簡稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結合后可以產生熒光,并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細胞內的DNA被碘化丙啶染色后,可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定,然后根據DNA含量的分布情況,可以進行細胞周期和細胞凋亡分析。

操作步驟:
1、對于懸浮細胞,直接離心收集細胞,棄上清,在4 ℃、1200rmp下用預冷的PBS洗細胞兩次;對于貼壁細胞,先用不含EDTA的0.25%的胰酶消化再離心收集細胞;
2、加入預冷的70%乙醇(PBS配制),于4℃固定過夜,或-20℃長期固定;
3、離心收集細胞,以1 mL預冷的PBS洗細胞一次,加入預冷的 PBS重懸細胞,調整細胞濃度為1.0×106,取出100 ul細胞懸液,加入RNase A酶,使RNase A終濃度為1 mg/ml,混勻后37 ℃水浴30 min;
4、加入PI綜合染色液,使PI終濃度為50 ug/mL,混勻,4℃冰箱避光保存;
5、300目尼龍網過濾后,上機檢測。

注意事項:
1、細胞濃度一定要≧1×106/ml,特別是陰性對照管細胞量要大一些,以便樣品電壓調節;
2、必須保證被檢測樣品為單細胞懸液;
3、如果樣品細胞為培養的貼壁細胞,將上清轉入離心管(其中含有脫落的凋亡細胞),與不含EDTA的胰酶消化的細胞合并后離心收集細胞;
4、在細胞固定時一定要將細胞吹開,吹成單細胞懸液;
5、RNAse與PI綜合染液分開的原因是RNAse的作用最適溫度是37℃,而不是4℃,所以與教材有所不同;
6、PI綜合染液不能用蒸餾水配,否則細胞全部溶解,造成結果不可靠;
7、4℃過夜一般隔天就進行檢測,如果想推遲幾天測,那就保存在-20℃,有資料顯示-20℃可以至少保存一個月;
8、70%~75%的酒精都可以用于PI單染固定。

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