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免疫組化標準方案 (福爾馬林固定石蠟包埋)

1. 實驗材料

(1) PBS

(2) Clearing and rehydration試劑:Histoclear II、100%、90%和70% 酒精

(3) 熱誘導表位恢復試劑試劑(Heat induced epitope retrieval; HIER):10mM檸檬酸鈉,PH6.0

(4) 抗原恢復試劑(Antigen retrieval):蛋白酶K和胰蛋白酶

(5) 內源性過氧化酶封閉液:0.3%H2O2

(6) 封閉液:含10%FBS的PBS,FBS種屬與二抗來源種屬一致

(7) 一抗:純化或生物素化規格(供二步法使用)

(8) 二抗:生物素化。(供三步法用)

(9) 放大劑:抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(cat#18-4100)

(10) 顯色劑:30% H2O2儲液,二氨基聯苯胺(DAB)1%儲液。

(11) 細胞核復染試劑:蘇木素(Hematoxylin)

(12) 包埋劑:封蓋膠(Fisher Scientific)

2. 實驗方案

(1) 石蠟包埋,切片。

(2) 50-60度烤箱中干燥烘烤20分鐘(注意:溫度不能超過60度以免破壞靶抗原)。

(3) 對載玻片進行如下洗滌和孵育程序,以除去石蠟和水化:Histoclear II 3 x 5 分鐘, 100% Ethanol 2 x 5 分鐘, 90% Ethanol 1 x 5 分鐘, 70% Ethanol 1 x 5 分鐘, ddH2O 1 x 5 分鐘(注意:充分浸入,除去氣泡,避免組織過分干燥以免影響后續染色)。注:若抗原在固定時容易交聯(影響一抗的特異性),則需要蛋白酶消化或枸櫞酸鹽緩沖液中加熱除去交聯。抗原修復方法依照靶抗原選擇,建議沒有修復的和修復后的抗原同時進行。

(4) (可選)熱修復抗原表位(HIER):將玻片完全浸沒于修復液中,微波加熱煮沸15min,再置于枸櫞酸鹽緩沖液中冷卻至室溫。

(5) (可選)抗原修復(蛋白消化法):將玻片浸入蛋白酶K或胰蛋白酶中,37度孵育20min,冷卻至室溫。

(6) 用 PBS小心洗滌兩次,每次5分鐘,浸沒,低速搖晃。

(7) 如果最后要使用過氧化物酶顯影,則將玻片浸入0.3%H2O2中室溫15-40min,除去過氧化物酶。注意:個別組織孵育時間依照過氧化物酶含量調整。

(8) 用 PBS小心洗滌三次,每次5分鐘,浸沒,低速搖晃。

(9) 用10%的正常血清封閉組織上非特異性位點,100-150ul/slide,室溫封閉1小時,為防止封閉液蒸發,可以使用石蠟封口膜輕輕覆蓋切片,避免拉伸和產生氣泡,置然后于濕盒中。

(10) 用鑷子小心的除去封口膜,將玻片用 PBS小心洗滌1次,每次5分鐘,浸沒,低速搖晃。

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