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免疫共沉淀及WB檢測方案

實驗材料:

  Mouse, Rabbit 或Goat IgG TrueBlot™

  TrueBlot™ Ig IP 微球 or Protein A 或 G 微球

 

實驗設備

  SDS-PAGE電泳及轉膜相關設備和緩沖液;

  微量移液器;

  搖床;

  PVDF或nitrocellulose膜;

  WB結果檢測設備及底物

實驗步驟

  1). 免疫共沉淀(IP)和SDS-PAGE電泳

  (1) 細胞裂解:往107/ml細胞中加入適量預冷的細胞裂解液和蛋白酶抑制劑,混勻4度孵育30-60分鐘后10000g離心15min,保留上清液。布氏法檢測蛋白濃度后,將樣品稀釋為1μg/μl左右。可-80度凍存或繼續下一步。

  (2) 細胞裂解物的預清洗:加50ul之前用裂解液稀釋的相應種屬Ig IP Beads(or Protein A/G beads)到裝有500ul細胞裂解物的離心管中,冰上孵育30-60分鐘;2500×g離心2-3分鐘后把上清液(不能帶沉淀微球)轉移到新的離心管中。

  (3) 免疫共沉淀:在裝有預清洗后的細胞裂解物的離心管中加入1-10ug的一抗,4°C孵育 1-2小時或者搖晃過夜。再加入50ul用裂解液預處理過的Ig IP Beads(or Protein A/G beads),4°C混勻孵育1-2小時或搖床過夜后2500×g離心0.5分鐘(可以和一抗一起孵育)。盡量完全地移去上清液并用500ul預冷的裂解液洗滌3次(每次都要離心棄完上清,有利于降低背景)。

  (4) 最后一次洗滌并小心的吸掉上清液后,加入50ul 1X Laemmli sample buffer(或含50mM DTT的SDS Sample Loading Buffer)(注意Sample Loading Buffer成分必須含有還原劑)。Vortex混勻后加熱至90-100℃,10分鐘。10000×g離心5分鐘,小心收集上清。10-30ul上樣電泳,避免上樣Beads。

  注:收集的上清液可以置于-20°C保存。用時解凍后,加入新鮮的DTT并加熱至90-100℃十分鐘。10000×g離心5分鐘,收集上清進行上樣電泳。

  2). 免疫印跡(Western Blotting)

  (1) 如前所述SDS-PAGE電泳結束。

  (2) 把蛋白質從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移至NC膜上。麗春紅-S染色鑒定是否轉膜成功,考馬斯亮藍對SDS-PAGE進行染色分析轉膜效率,蒸餾水或TBST清洗麗春紅。

  (3) 在通風柜里,將NC膜在True Blot enhancer buffer 浸泡2min,TBST清洗一次。

  (4) 將NC膜浸入5%的脫脂奶粉的封閉液中,置于搖床上室溫封閉2小時。

  (5) 棄去封閉液后,加入靶蛋白一抗(用5%脫脂奶粉封閉液稀釋,終濃度需要預實驗摸索,建議1-2ug/ml)。置于搖床上室溫孵育2小時或者4℃孵育過夜。

  (6) 用TBST洗滌膜4-5次,每次5-10分鐘。

  (7) 棄去洗液后加入適量的用5%脫脂奶粉封閉液稀釋好的TrueBlot™(稀釋比為1:1000),室溫孵育1小時。

  (8) 用PBST或TBST洗滌膜4-5次,每次5-10分鐘。

  (9) 用合適的過氧化物酶HRP化學發光底物并按照說明(等量的底物A+底物B)進行顯色反應。

  (10) 在暗室中用X光片曝光,根據結果調整曝光時間(10sec、1min、5min和20min)和曝光區域,以得到最佳效果。

  3). 注意事項

  (1) 免疫共沉淀抗體的稀釋:用于免疫共沉淀的抗體在使用之前需要進行稀釋,例如使用濃度為1-5ug/107細胞/ml。一般對于從107細胞裂解出的大部分蛋白抗原來說,加入2ug抗體就足夠了。因為盡量減少抗體用量可以降低還原性沉淀抗體對SDS-PAGE電泳樣品檢測的干擾。(TrueBlot™并不能增強免疫印跡中抗體和抗原之間的特異性結合,所以如果用于WB的抗體能與非目的蛋白產生交叉反應,結果也會被TrueBlot™檢測出來)

  (2) WB的封閉:Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot™檢測過程中的膜封閉,一抗稀釋孵育和TrueBlot™稀釋孵育過程都建議使用5%(w/v)的脫脂奶粉液。BSA不建議使用于此過程。

  (3) 陽性對照:Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot™檢測SDS-denatured, non-reduced mouse IgG,所以可用20ng non-reduced沉淀抗體直接上樣電泳,然后WB作為IgG TrueBlot™的陽性對照。

  (4) 陰性對照:WB過程中不加一抗,直接加二抗TrueBlot™ beads。

  (5) SDS-PAGE電泳及WB:Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot™檢測過程為用含適量抗氧化劑上樣液電泳,然后Poncean S預染和20%的乙酸/30%甲醇脫色;再室溫自然晾干1小時,用含甲醇的Buffer A潤膜后封閉。這個操作過程可以得到很好的WB結果,PVDF膜或硝酸纖維膜都適用于此檢測過程。

  4).相關緩沖液配方:

  2X SDS Reducing Sample Loading Buffer (包含50 mM DTT)

  950 mL 2X SDS sample buffer

  50 mL 1M DTT

  注: 1小時內使用,過期丟棄。.

  2X SDS Sample Buffer

  6% SDS

  25mM Tris base pHed to 6.5 with HCl

  10% glycerol

  Bromphenol blue

  注: -20°C長時間儲存 ,室溫最多只能儲存一月。

  TBS-Tween (TBS-T):

  25 mM Tris-HCl, pH 8.0

  125 mM NaCl

  0.1% Tween 20

  Blocking Buffer:

  5g 脫脂奶粉

  100ml TBS-T

  調整PH值為7.4

  Antibody Binding Buffer:

   含1% 脫脂奶粉 TBS-T

  Protease Inhibitor Cocktail (100X):

  PMSF, 5mg (50μg/ml)

  Aprotinin, 100μg (1μg/ml)

  Leupeptin, 100μg (1μg/ml)

  Pepstatin, 100μg (1μg/ml)

  Phosphatase Inhibitor (100X):

  1mM Na3VO4

  1mM NaF

  注: IP: Immunoprecitaton免疫共沉淀. WB: Western Blot蛋白質印記

參考文獻:

1. Alegria-Schaffer A, Lodge A, Vattem K. 2009. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 2009;463:573-99.

2. Haan C, Behrmann I. 2007. A cost effective non-commercial ECL-solution for Western blot detections yielding strong signals and low background. J Immunol Methods. Jan 10;318(1-2):11-9.

3. Immunoblot affinity purification. 2005. Nature Methods 2, 797 – 798.

4. Uhlig U, Uhlig S, Branscheid D, Zabel P, Vollmer E, Goldmann T. 2004. HOPE technique enables Western blot analysis from paraffin-embedded tissues. Pathol Res Pract. 2004;200(6):469-72.

5. Wu M, Stockley PG, Martin WJ 2nd. 2002. An improved western blotting technique effectively reduces background. Electrophoresis. Aug;23(15):2373-6.

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