ELISA

您現在的位置:首頁 - 技術中心 - 實驗方法 - ELISA

ELISA Ready Set Go標準實驗方案

注意:
1.試驗中使用特定試劑盒的標準品和抗體,不建議不同試劑盒產品調換,因為可能影響結果準確性。
2.標準曲線孔建議做2-3個復孔。
3.稀釋用的緩沖液中不能含有疊氮化鈉,因為其可以滅活辣根過氧化物酶。

標準品稀釋(如下圖)
1.按照C of A說明使用檢測稀釋液配制濃度為500pg/ml 的標準品溶液。
2.在高親和ELISA板子中從B1和B2開始到H1和H2每孔分別加入100ul檢測稀釋液。
3.取200ul的濃度為500pg/ml的標準品加入到A1和A2兩個孔中。
4.用排槍從A1和A2兩個孔中吸取100ul加入到對應的B1和B2中,吹吸混合均勻,那么 B1和B2標準品濃度為250pg/ml。
5.從B1和B2中吸取100ul加入到C1和C2孔中,混勻,那么C1和C2孔標準品濃度為125pg/ml。
6.按照步驟4和5的方法倍比稀釋到H1和H2兩孔。H1和H2孔中標準品的濃度是4pg/ml,體積為200ul,取100ul棄掉。屆時每個孔標準品的體積均為100ul。
注意:4到6步驟稀釋速度要快,避免時間過長,建議使用多通道排槍進行。
7.設置A3和A4為空白對照(只加100ul稀釋液),為了避免胡克效應的影響,我們建議可以采用A1和A12作為空白對照孔,而不設置樣品或標準品。

結果計算:(需要從標準品OD值擬合出來方程來推算樣品的細胞因子的含量)。
1.計算標準品,空白和樣品孔平均OD值。
2.樣品OD值減去空白孔平均OD值。
3.利用軟件擬合出4參數的對數標準曲線,也可以使用描點的方法在坐標中描繪出X軸為標準品濃度,Y軸為平均OD值的各個點,然后大致擬合出相應的曲線。最佳的方法是使用回歸分析的方法擬合出標準曲線。
4.利用標準曲線擬合的公式去計算樣品中細胞因子的濃度。
5.如果在實驗前樣品經過稀釋,則結果需要乘于稀釋倍數。

儲存和穩定性說明
1.EB的ELISA試劑盒若按照說明書儲存保質期為6個月。
2.試劑盒提供凍結的標準品20ul/瓶,收到后請立即凍存與-80度冰箱,可保存6個月;使用時融化離心1分鐘,可避免標準品損失。請避免將標準品分裝和反復凍融。每瓶標準品只能用一次,剩余失效。稀釋標準品步驟請參照說明書第一部分。
3.ELISA板子請室溫儲存,其他試劑4度儲存即可。

實驗材料:

功能純化級別的捕獲抗體。
結合生物素的檢測抗體。
標準品。
10×ELISA包被緩沖液。
5×檢測稀釋液。
抗生物素的辣根過氧化物酶。
TMB底物。
高親和力96孔板(NUNC Maxisorp flat-bottom or Corning Costar 9018)。
1×PBS+0.05%吐溫20(或者ELISA洗液 Cat.No. 00-0400)
終止液:1M H3PO4 或者2N H2SO4

儀器

吸管和單通或多通移液器
冰箱
排槍水槽
分光光度計
洗板機

實驗流程:

1.使用無菌水將包被液稀釋為1×(注意:預先將包被液平衡至室溫)。
2.用1×包被液稀釋功能級別的包被抗體,包被ELISA板子,每孔100ul,蓋板,四度孵育過夜。
3.第二天稀釋檢測稀釋液(雙蒸水稀釋),吸出板子的捕獲抗體溶液,用300ul洗液洗板3-5次,每次浸泡時間不小于1min,吸水紙上排干。
4.200ul檢測稀釋液封閉板子,蓋板,室溫孵育1小時。
5.吸去檢測稀釋液,用300ul洗液洗板3-4次,每次浸泡時間不小于1min,吸水紙上排干。
6.按照上述說明使用1×檢測稀釋液稀釋標準品(嚴格按照說明書進行)。
7.加100ul樣品和標準品到對應的孔中,封板,室溫孵育2個小時或4度過夜(高靈敏度)。
8.孵育期間,按照說明書準備檢測抗體。
9.吸去樣品,用300ul洗液洗板5次,每次浸泡時間不小于1min,吸水紙上排干。
10.每孔加100ul檢測抗體,封板,室溫孵育1個小時。
11.孵育期間,按照說明書準備抗生物素的HRP溶液。
12.每孔加100ul抗生物素的HRP溶液,封板,室溫孵育0.5個小時(避免溶液中有疊氮鈉,因為會影響HRP活性)。
13.吸去溶液,用300ul洗液洗板3-4次,每次浸泡時間不小于1min,吸水紙上排干。
14.每孔加100ulTMB溶液,封板,室溫孵育15min(注意:TMB要預先平衡至室溫)。
15.加50ul終止液終止。
16.加終止液后30min內檢測,450nm讀板。

附錄:緩沖液配制方法

1X PBS:
 80.0 g NaCl
 11.6 g Na2HPO3
 2.0 g KH2PO4
 2.0 g KCl
 以 1 L DI H2O定容 并調節 pH 值為 7.0

ELISA Wash Buffer:
 1 L 的1X PBS
 0.5 mL Tween-20
 此外, 也可以購買ELISA洗液干粉 (eBio cat. # 00-0400) ,用1 L DI H2O重懸。

分享到:
返回
2020无码最新国产在线观看-无码国模国产在线观看-最新国模无码国产在线视频_福利